综述:眼内液病原学检测的研究进展


我想在昨天分享的应用程序

眼内液致病性检测研究进展

中华眼科杂志,Vol。 52 No. 2018 July 7 Chin J Ophthalmol,2018年7月,Vol。 54,No。7

陶勇

【摘要】感染性眼病包括病毒性视网膜炎,眼内炎和眼弓形虫病是常见的盲目性疾病。传统的血清学检测很难帮助诊断和治疗这些疾病,甚至可能产生误导。检测眼内液中病原微生物的核酸,抗体和细胞因子,包括房水和玻璃体液,可以提供关于局部病原体和眼内免疫反应的临床信息,这有助于快速诊断。本文总结分析了眼内液病原体检测的最新研究进展,为临床工作提供参考。 (Chinese Journal of Ophthalmology,2018,54:551-556)

【关键词】房水;眼部感染;细胞因子;诊断技术,眼科

基金项目:1351人才培养 - 朝阳新星计划(CYXX-2017-21);国家高技术研究与发展计划

(2015AA)

眼内液检查对感染性眼病的诊断研究陶勇,Tao Yong北京首都医科大学附属北京朝阳医院眼科,通讯作者:陶勇,电邮:

包括病毒性视网膜炎,眼内炎和眼弓形虫病等,传染性眼病包括病毒性视网膜炎,眼内炎和眼弓形虫病等,是引起瘫痪的常见原因。传统的血清检查在诊断这些疾病方面的作用有限,有时会产生误导。检查眼内液中的病原体DNA,抗体和细胞因子,包括房水和玻璃体液,可以帮助临床医生获取原位信息,从而快速确诊。 (Chin J Ophthalmol,2018,54: 551-556)

[关键词]房水;眼部感染;细胞因子;诊断技术,眼科

基金计划: 1351人才培训计划(CYXX-2017-21);国家

眼内液是眼球中液体的总称,包括房水,玻璃体液,视网膜下液和脉络膜液。眼球是具有血眼屏障的封闭球体(包括血液 - 水屏障和血 - 视网膜屏障)。因此,检测血液中的病原微生物和免疫指标很难准确反映眼睛的局部情况,甚至可能产生误导。原位材料可以更好地反映眼睛微环境的变化,对于鉴别传染性眼病的病因,判断免疫指标的变化具有重要意义。随着分子生物学技术的快速发展,临床使用的眼内液检测新技术正在增加。与传统的检测方法相比,该方法在检测速度,准确性和特异性方面具有优势,尤其对于传染性眼病的诊断和治疗。

首先,获取眼内液

(1)住房用水

在服用前房水前,必须先使用抗感染滴眼液(如妥布霉素滴眼液,氧氟沙星滴眼液等)。如果您在同一天进行手术,可以在前房穿刺前每5分钟点击一次眼睛,共6次。将穿刺环境进行紫外线灭菌40分钟。在结膜囊中每3分钟施用一次表面麻醉剂,对皮肤进行消毒,并将结膜囊洗涤3次。在裂隙灯显微镜下进行前房穿刺。使用25 G(相当于1 ml注射器)或更细尖的注射器;穿刺位于透明的角膜缘上。建议将针插入5点钟位置。针尖位于7点钟位置。针的尖端面向外科医生。该角度的优点是不容易意外伤害镜片,角膜内的隧道长而且易于自闭;在针尖进入前房后,将针缓慢向外拉出,取出0.05~0.10ml的房水,拔出针尖。

(2)玻璃体液

也可以使用注射器直接提取玻璃体液。

1.玻璃体引流:手术室消毒和玻璃体腔注射眼部治疗。使用23 G针头(相当于2 ml注射器),连接1 ml注射器针头,下肢外侧4.0 mm(3.5 mm无无晶体眼),穿过巩膜,然后将针头垂直插入针头1/2针。长度进入玻璃体腔,针头向外拉,并提取0.3毫升玻璃体液以拔出针头。如果玻璃体液体没有平滑地绘制,请尝试旋转针头方向或略微改变针头角度和前后位置。

2.玻璃体切除术:尝试使用微创玻璃体切除术系统,如23 G,25 G和27 G.穿刺前,仔细检查周围眼底,避免眼睛明显的组织增生区域。在角膜缘外4.0mm处(3.5mm无无晶状体眼),在巩膜斜穿刺后斜向插入针,分别放置灌注和玻璃体切除插管。在泵送之前关闭灌注以确保没有灌注液进入玻璃体腔。在确保玻璃体切割管中没有液体的同时,拧下玻璃体切除器的管螺帽,并连接2.5 ml注射器针头,将切割频率设置为≥2500次/min。踩下踏板,慢慢向外拉出注射器针头,吸出0.3至0.5毫升的玻璃体液。打开灌注,恢复眼压,拔出插管,仔细检查穿刺口是否有泄漏。

第二,Goldmann-Witmer(GW)系数

当血眼屏障被破坏时,血清中的蛋白质成分(包括抗体)可能会渗入眼睛。如果此时眼内液的抗体成分为阳性,则容易引起临床误诊。通过计算GW系数,可以初始确定眼睛中的特定抗体成分是否原位产生或泄漏。 GW系数计算为(眼中的特定IgG浓度/眼中的总IgG浓度)/(血清的某些IgG浓度/血清的总IgG浓度)。 GW系数为0.5至<0。 2.0,表明没有眼内抗体产生; GW系数是2.0到&lt; 4.0,提示原位可能存在眼内抗体产生; GW系数≥4.0,原位确定眼内抗体。制作[1]。应当注意,使用GW系数的目的是排除假阳性,如果眼内液检测对于特定抗体是阴性的,则这是无意义的。还有很少使用的WitmerDesmonts系数和Dernouchamps抗体系数。 Witmer Desmonts系数与GW系数相似,不同之处在于总IgG被白蛋白替代,其计算为(眼中特定IgG浓度/眼中总白蛋白浓度)/(血清特异性IgG浓度/血清总量)白蛋白浓度)。该研究报告称,Witmer Desmonts系数≥1为阳性[2]。眼内炎是指由眼睛中的细菌或真菌感染引起的炎症反应。它是一种严重的眼病,可引起眼睛不可逆转的失明数小时至数天[3],其临床诊断具有较高的假阴性率。 [4-5]。通过玻璃体引流或诊断性玻璃体切除术获得样品,并在显微镜下观察染色的涂片并进行微生物培养以获得准确的致病信息。这种传统方法在临床实践中被广泛使用[6-8]。然而,微生物培养的阳性率仅为34%~60%[9-13],培养时间为3天~3周,因此很容易错过临床治疗的时机。显微镜观察染色涂片,人工寻找细菌,真菌,阳性率较低,一般为22.05%~36.0%[12,14-15],甚至仅为7.5%[12]。实时定量聚合酶链反应(PCR)是检测眼内炎的重要方法。与微生物培养相比,PCR检测的阳性率更高(表1)[11,16-18]。 Sugita等[19]报道逆转录PCR检测真菌的敏感性和特异性良好。通过逆转录PCR检测到5个微生物培养阴性的样本,均为阳性。在欧洲多个中心的16 600名白内障摘除患者中对29名眼内炎患者进行了微量培养和PCR检测。结果显示,PCR使阳性率增加了20%[11]。日本学者发现19例眼内炎患者中有18例PCR阳性,而只有10例微生物培养阳性结果阳性[20]。 PCR检测的优势在于快速诊断(90分钟内),与微生物培养相比,由于样品污染导致的假阳性可能性降低[21]。 Wu等[22]发现PCR检测的灵敏度优于微生物培养。缺点是不能进行抗菌药物的敏感性试验。

表1使用聚合酶链反应(PCR)和微生物培养的不同文献

image.php?url=0MpZPzQCnP

玻璃体液标本比房水标本更准确可靠[23-26]。 Sandvig和Dannevig [27]报道,在含水微生物培养阴性的眼内患者中,48%的玻璃体液含有正微生物生长。中国研究人员也获得了类似的结果,即3例眼房内没有检测到微生物水的眼内炎患者在玻璃体液中有微生物阳性结果;并且所有患有微生物液体检测微生物液体的玻璃体内液体的患者都没有检测到房水。微生物阳性结果[28]。为了确定病原微生物,经常使用玻璃体腔引流或玻璃体切除术[6-8],玻璃体切除术中微生物培养的阳性率(92%)高于玻璃体腔引流术(44%)[5]。这一结果的一个可能原因是通过玻璃体切除术获得的标本更接近视网膜表面[6]。结果表明,玻璃体切除术后4个标本中微生物培养阳性率为100%,4个标本中玻璃体切除术(细针)阳性率为0 [29]。荟萃分析结果显示,玻璃体内注射抗VEGF药物后,超过50%的眼内炎患者的微生物培养阴性。在微生物培养阳性的患者中,大多数微生物是凝固酶阴性葡萄球菌(38.24%),其次是链。 Cocci(29.41%)[30]。 Bharathi等[15]研究显示,66例眼内炎患者中,涂片镜检阳性仅5例(7.6%),微生物培养阳性16例(24.2%),PCR检测阳性率为65.2 %(43例),远远高于前两种方法。与不同的PCR检测方法相比,巢式PCR检测率高于单重PCR和多重PCR,特殊设计的巢式PCR也可用于鉴定革兰氏阳性菌和阴性菌[31]。 Tokman等人。 [32]报道多重PCR在识别厌氧细菌引起的眼内炎方面比微生物培养更有利。由于细菌中16S核糖体DNA的普遍存在,18S和28S核糖体DNA在真菌中普遍存在。研究人员为此功能设计了一种广谱PCR,并对其进行了扩增,以提高检测的灵敏度。快速鉴定细菌或真菌性眼内炎[20,33]有助于及时确认眼内炎及其性质。 Abrishami等[34]进一步研究了细菌16S核糖体DNA的广谱PCR扩增,并通过基因库分析了扩增产物,获得了大肠杆菌,阴沟肠杆菌,枯草芽孢杆菌等.12微生物的特定种类信息。多重PCR可在5-6小时内检测多种细菌,而单重PCR则需要8小时的热循环时间进行每次细菌扩增[35]。 DNA微阵列技术也已成功用于眼内炎的病原体检测,结果可在24小时内获得,显示其快速准确的优势[36]。 ARN是由病毒感染引起的视网膜坏死改变,疾病的快速发展和预后不良引起的。病原微生物主要是水痘带状疱疹病毒(VZV),单纯疱疹病毒(HSV)1型(HSV-1)和HSV-2 [37],偶尔也有巨细胞报道。引起病毒(巨细胞病毒,CMV)[38]和EB(爱泼斯坦 - 巴尔病毒)病毒[39]。 HSV-1,HSV-2和VZV DNA的PCR检测,或HSV和VZV抗体GW系数的检测,已包含在最新的ARN诊断标准中[40]。 PCR检测HSV,CMV和VZV的特异性和敏感性均高于90%[41]。根据美国眼科学会最近的一项研究,79%至100%的疑似ARN患者使用PCR检测房水或玻璃体液中是否存在HSV或VZV [42]。Tanaka-Kitajima等[43]使用PCR检测3岁儿童ARN房水中的HSV-2 DNA。 Abe等[44]证实,不仅通过PCR检测HSV和VZV病毒核酸对ARN的诊断具有特异性,而且还检测到HSV和VZV抗体以及GW系数的计算。印度研究人员甚至发现,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HSV和VZV抗体对ARN诊断更为敏感。 PCR检测HSV和VZV核酸阳性率分别为6.7%和23.3%,而ELISA检测HSV和VZV抗体阳性率分别为43.3%和80.0%[45]。对眼内液细胞因子进行了研究,结果显示与对照组相比,IL-6,IL-8,IL-18,巨噬细胞移动抑制因子,单核细胞趋化蛋白1,嗜酸性粒细胞活化促炎因子如细胞因子,诱导蛋白10, ARN患者的眼内液中IL-15,可溶性细胞间粘附分子1和可溶性血管细胞粘附因子1显着增加,并且患者的眼内液中炎症反应因子IL-10的浓度也显着升高。 ARN [46]。眼内液成分检测结果可部分指示ARN的预后,如眼内液中VEGF含量和视网膜病变范围(P <0.01),这与视力预后不良有关[P=0.031] [47]。如果VZV或HSV在前房的DNA载量超过5.0×10 9/L,则ARN患者的预后更差,视网膜脱离的可能性更高[48]。

(C)巨细胞病毒性视网膜炎

巨细胞病毒性视网膜炎发生在免疫力低下的患者(如器官移植,后天免疫机能丧失综合症),这是由CMV直接破坏视网膜组织细胞引起的。用于检测CMV的传统方法包括包含抗体检测,电子显微镜检查,病毒分离等。然而,由于操作复杂,周期长且设备昂贵,临床方法常常被更快速和有效的方法所取代,例如CMV的早期检测。通过ELISA。通过核酸序列依赖性扩增方法检测产物pp65抗原pp67-mRNA,并且在更多病例中使用PCR检测DNA [49-50]。 Seehofer等[51]检测了135例肝移植患者的pp65抗原,pp67-mRNA和CMV-DNA,发现其敏感性和阴性预测值均为100%,而pp67-mRNA的阳性预测值为67%。 pp65抗原为80%,通过实时定量PCR检测的CMV-DNA的阳性预测值为89%。可以看出,CMV-DNA的实时定量PCR检测更有利。实时定量PCR过于敏感,样品加载或加工的微小差异可能导致最终测试结果的巨大差异。因此,该方法对于定性和半定量检测更好,并且不适合于绝对定量确定眼内CMV含量是否由于治疗效果而降低。 件的改善,IL-8的浓度梯度逐渐降低,包括视网膜血管白鞘的消退,视网膜水肿的减少和出血的减少。因此,房水中IL-8的浓度可用作巨细胞病毒视网膜的活性靶标。

(4)眼部毒蕈病

诊断眼弓形虫病的金标准是在眼睛中找到毒蕈虫,但其操作风险更大。在临床实践中容易忽略眼眶恙虫病,因为检测方法尚未推广,并且难以通过PCR检测弓形虫的核酸。 Lim等[52]报道23例血清素抗体阳性葡萄膜炎患者无阳性眼内液和血痰核酸检测阳性患者。通过ELISA检测血清中的弓形虫抗体适用于内脏弓形虫病的诊断,而不适用于眼弓形虫病。即使稀释浓度非常低,仍有许多临床典型的眼弓形虫病患者无法检测到血清毒蕈抗体。 Stewart等[53]对22例眼蛔虫病患者进行了ELISA检测,发现50%的患者Toxocaria抗体阳性,36%阴性,14%不清楚。 De Visser等[54]测试了37名成人和12名不同葡萄膜炎原因的儿童弓形虫血清和眼内液。结果显示,5名成年患者血清芦笋抗体阳性,但眼内液检测结果均为阴性; 3例患儿眼内液螨阳性,与临床表现一致,相应的GW系数也显着增加。研究结果表明,血清弓形虫抗体的检测存在假阳性的可能性,体内含有幽门液和玻璃体液的眼内液螨的检测是一项更有说服力的试验。 Alabiad等[55]报道,血清素抗体阴性的后葡萄膜炎患者没有有效的抗菌和抗炎药物,前房水试验确认了眼睑蚜虫的阳性抗体。眼内IgE滴度高于血清IgE滴度,对眼弓形虫病的诊断具有良好的暗示作用[56-57],其敏感性可高达92.75%[58]。

目前,对眼睛中抗体滴度的正常范围没有统一的理解。血清检测标准基本上用于正面和负面判断,并且可能存在错误。因此,建议进行多中心临床研究,以进一步探索和阐明正常值的参考范围。

(5)眼弓形虫病

诊断眼弓形虫病的金标准是通过ELISA检测眼内液体中的弓形虫抗体[59],特异性和敏感性分别为63%和89%[60]。在弓形虫正常免疫的患者中,可以在30%至40%的患者房水中检测到弓形虫核酸;在免疫力低下的患者中,弓形虫可以增加到75%[59]。检测眼内液中的弓形虫抗体非常重要,尤其是GW系数[61-62]。 Mahalakshmi等[2]的结果表明,在典型弓形虫病患者中,68.4%的患者具有阳性Witmer Desmonts系数,52.6%的患者具有弓形虫核酸PCR阳性,但在对照组中,所有检查者眼中弓形虫的DNA检测结果为阴性,而Witmer Desmonts系数显示假阳性为3.8%至25.0%。可以看出,对于眼弓形虫病,弓形虫核酸PCR检测的特异性较好,而Witmer Desmonts系数的灵敏度较高,将两者结合起来非常重要。

(6)结核性葡萄膜炎

结核性葡萄膜炎的临床诊断仍然很困难,需要结合病史,感染史,体征和治疗反应。印度文献报道,通过PCR检测结核性葡萄膜炎患者的眼内液中结核分枝杆菌可能与结核病的高发病率和眼球受累增加有关。 Biswas等[63]的结果支持以下结论:在多灶性脉络膜炎患者中,眼内结核中结核分枝杆菌核酸阳性的比例为41.4%(12/29),其特征是脉络膜或睫状体比例体积脓或结核瘤患者的比例为81.82%(9/11)。在印度13例多灶性脉络膜炎患者中,9例结核分枝杆菌核酸阳性(其中2例合并CMV和HSV)[64]。 Bansal等[65]结合多种分子检测方法检测了11例疑似结核性葡萄膜炎患者的玻璃体液,结果显示10例(90.9%)结核分枝杆菌核酸阳性,并判断是否有利福平耐药。研究报道,5例疑似结核性葡萄膜炎患者的玻璃体液中采用逆转录PCR检测到85B mRNA,阳性率为100.0%,证实了结核性葡萄膜炎的诊断。在5名患者中,3名结核菌素皮肤试验阴性,2名γ干扰素释放试验阴性。与实时定量PCR相比,逆转录PCR可以减少结核病检测室中由结核分枝杆菌污染引起的假阳性,因为当结核分枝杆菌复制时可以表达85B mRNA表达。在同一组患者中培养结核分枝杆菌的时间是在1个月后[66]。

四,前景

在传染性眼病的情况下,收集完整的病史是正确诊断的第一步。全面的眼科检查是诊断的重要证据,病原微生物的检测是诊断的金标准。由于眼内液是用于侵入性手术并且具有引起眼内感染的风险,因此其临床应用受到限制。然而,眼内液测试比血清学测试具有更大的优势,血清学测试可以更好地反映眼睛中的微环境。随着各种分子检测技术的进步,可检测的微生物种类和范围,检测的准确性和时间不断提高,因此在规范获取眼内液的操作程序的基础上,采用微创玻璃体切除术促进和手术系统的发展[67],眼内液检测将被更多的临床医生所接受,将有助于改善包括传染性葡萄膜炎在内的传染性眼病的临床诊断和治疗。

附件:原始图片

image.php?url=0MpZPzYtvr

image.php?url=0MpZPzquQA

image.php?url=0MpZPzTDV5

image.php?url=0MpZPz17ry

image.php?url=0MpZPzYfsn

image.php?url=0MpZPzCfwL

收集报告投诉